-
1. EINLEITUNG
-
Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf Peptide und Proteine, die
zum Hemmen einer Infektion oder Zellwucherung verwendet werden können. Sie
beruht zumindest teilweise auf der Entdeckung von aus Embryonalgewebe
isolierten Peptiden und Proteinen, bei denen festgestellt wurde,
dass sie eine antiproliferative Wirkung auf eine Vielzahl von Krebszellen
aufweisen und/oder als Breitband-Antivirusmittel wirken.
-
2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf Peptide, die antiproliferative
Aktivität
aufweisen. Diese Moleküle
wurden als Teil einer Forschungsinitiative isoliert und gekennzeichnet,
um Faktoren zu identifizieren, die für das empfindliche Gleichgewicht
zwischen den während
der Embryogenese wirkenden proliferativen und antiproliferativen
Kräften
verantwortlich sind. Die Forschung wurde auf der Theorie aufgebaut,
dass eine Schwangerschaft bildlich gesprochen wie ein reversibles
Karzinom funktioniert, da die Produkte der Empfängnis wie ein Karzinom invasiv
sind und in die Blutbahn dringen. Embryonale Zellen und deren Turmorzell-Gegenstücke exprimieren ähnliche
Oberflächenantigene
(z. B. Alphafetoprotein und carcinoembryonales Antigen) und sezernierte
Faktoren. Weiters wird der Konzeptus wie ein Tumor nicht vom Körper der
Mutter abgestoßen,
sondern macht sich vielmehr mütterliche
Ressourcen zunutze, um sein Wohlbefinden zu sichern. Anders als
beim Krebs sind die Invasivität
und die Toleranz, die mit einer Schwangerschaft einhergehen, jedoch beinahe
jederzeit umkehrbar.
-
Wie
im
U.S.-Patent Nr. 5,648,340 von
Dr. Barnea beschrieben, wurden Wirkstoffe identifiziert, die dahingehend
wirken, die Entwicklung des Embryos zu steuern, so dass Wucherung,
Invasivität
und Differenzierung auftreten können,
ohne den mütterlichen
Wirt wesentlich zu schädigen.
Es wurde festgestellt, dass mehrere vom Embryo produzierte Wirkstoffe
bei dessen Entwicklung eine wichtige Rolle zu spielen scheinen.
Das
U.S.-Patent Nr. 5,648,340 offenbart
die Reinigung von Proteinextrakten mit Molekülmassen von weniger als 10.000
Dalton (und insbesondere weniger als 8.000 Dalton, die antiproliferative
Aktivität
aufweisen, und solcher von weniger als 3.000 Dalton, die proliferative
Aktivität
aufweisen.
-
Die
im
U.S.-Patent Nr. 5,648,340 beschriebenen
Proteinpräparate
wurden nun einer weiteren Analyse unterzogen, und es wurde festgestellt,
dass Proteine aus Fraktionen des Extrakts, die eine hohe Molekülmasse aufweisen,
sowohl eine antiproliferative Wirkung auf Krebszellen als auch eine
antivirale Breitbandwirkung aufweisen und dass Fraktionen des Extrakts,
die eine geringe Molekülmasse
aufweisen, einen aktiven antiproliferativen Wirkstoff umfassen,
bei dem es sich um ein Heptapeptid mit einer Molekülmasse von
etwa 820 Dalton handelt.
-
Insbesondere
wurde beobachtet, dass die eine höhere Molekülmasse aufweisenden Subfraktionen der
Proteine, die im
U.S.-Patent
Nr. 5,648,340 beschrieben sind, die Wucherung verschiedener
Typen von Krebszellen und ebenso den cytopathischen Effekt einer
Vielzahl von Viren, einschließlich
Viren der Retrovirus-, Bunyavirus-, Togavirus-, Reovirus-, Herpesvirus-
und Pockenvirus-Familie, hemmten. Diese Viren sind strukturell extrem
unterschiedlich und üben
ihre Effekte durch verschiedene biologische Mechanismen aus.
-
Retroviren,
wie z. B. die humanen Immundefizienzviren Typ 1 und 2, sind RNA-Viren, welche ihre
genomische RNA als Teil ihres Replikationszyklus reversetranscribieren.
In der DNA („Provirus")-Form sind sie imstande,
sich in chromosomale Wirt-DNA
zu integrieren, wo sie für
längere
Zeiträume
fortbestehen können. Bunyaviren
sind durch Gliederfüßer übertragene
Viren, die Negativstrang-RNA als ihr genetisches Material verwenden.
Beispiele für
Mitglieder der Bunyaviridae-Familie sind das Bunyamwera-, das Uukuniemi-,
das La-Crosse-, das Punta-Toro- und das San-Angeln-Virus sowie das
Rifttal-, das Sandfliegen- und das Krim-Kongo-Hämorrhagisches-Fieber-Virus.
Togaviren sind ikosaedrische Positivstrang-RNA-Viren und umfassen
zahlreiche Viren, die beim Menschen krankheitserregend sind. Zu
den Togaviren zählen
das östliche
Pferdeenzephalitis-, das westliche Pferdeenzephalitis-, das venezolanische
Pferdeenzephalitis-, das Sindbis-, das Chikungunya-, das Semiliki-Forest-,
das St.-Louis-Enzephalitis-, das Gelbfieber-, das Röteln- und
das Dengue-Virus. Reoviren sind doppelsträngige RNA-Viren, die häufig mit
Durchfallerkrankungen in Zusammenhang gebracht werden. Im Gegensatz
dazu sind Herpesviren und Pockenviren doppelsträngige DNA-Viren. Die Herpesvirus-Familie
umfasst das Herpes-simplex-Virus 1 und 2, das Varicella-Zoster(Windpocken)-Virus
und das Epstein-Barr-Virus. Die Pockenvirus-Familie umfasst das
Variola(Pocken)-Virus und das Vacciniavirus.
-
Die
Fähigkeit
von Protein der eine hohe Molekülmasse
aufweisenden Fraktion eines Embryonalextrakts, den cytopathischen
Effekt von Viren aus jeder dieser Virusfamilien sowie die Wucherung
verschiedener Typen von Krebszellen zu hemmen, legt nahe, dass es
eine allgemein schützende
Wirkung auf Zellen ausübt, was
Teil des biologisch privilegierten Status des sich entwickelnden
Embryos ist.
-
3. KURZFASSUNG DER ERFINDUNG
-
Ein
Protein, das in einer eine hohe Molekülmasse aufweisenden Subfraktion
eines Säugetier-Embryonalextrakts
enthalten ist, und seine Verwendung als antiviraler Wirkstoff werden
geoffenbart. Dies beruht zumindest teilweise auf der Entdeckung,
dass eine gereinigte, eine hohe Molekülmasse aufweisende Fraktion eines
embryonalen Säugetierproteins
antivirale Wirksamkeit gegen ein Spektrum nicht verwandter Viren,
einschließlich
des humanen Immundefizienzvirus Typ 1, des San-Angeln-Virus, des
Affen-Rotavirus, des Herpes-simplex-Virus Typ 1, des Vacciniavirus
und des venezolanischen Pferdeenzephalitis-Virus, aufwies. Der antivirale Effekt
kann gegen eine Vielzahl von DNA- oder RNA-Viren gerichtet sein.
-
Weiters
werden ein Protein, das in einer eine hohe Molekülmasse aufweisenden Subfraktion
eines Säugetier-Embryonalwirkstoffs
enthalten ist, und seine Verwendung als antiproliferativer (z. B.
Antikrebs-) Wirkstoff geoffenbart. Dies beruht zumindest teilweise
auf der Entdeckung, dass eine gereinigte, eine hohe Molekülmasse aufweisende
Fraktion eines embryonalen Säugetierproteins
antiproliferative Wirksamkeit gegen verschiedene Typen von Krebszellen,
einschließlich
Lungen-, Brust- und Kolonkrebszellen, Leukämiezellen, Melanomzellen und
des nicht kleinen Lungenzellen-Zellkarzimoms, aufwies.
-
Weiters
werden gereinigte und isolierte Peptide geoffenbart, welche die
Aminosäuresequenz
Cys Val His A B Arg C aufweisen, wobei A ausgewählt ist aus der Gruppe von
Aminosäuren,
bestehend aus Ala, Ser und Thr, B ausgewählt ist aus der Gruppe von
Aminosäuren,
bestehend aus Tyr und Phe, und C ausgewählt ist aus einer Gruppe von
Aminosäuren,
bestehend aus Ala und Ser.
-
Pharmazeutische
Zusammensetzungen, die diese Proteine und Peptide umfassen, und
Verfahren zum Hemmen einer Virusinfektion und Zellwucherung, die
das Verabreichen einer wirksamen Menge an Protein(en) oder Peptid(en)
an einen eine solche Behandlung benötigenden Patienten umfassen,
werden ebenfalls geoffenbart. Die erfindungsgemäßen Peptide können als
solche bei der Behandlung von Karzinomen nützlich sein.
-
4. KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
-
1.
DEAE-Chromatogramm eines Materials von hoher Molekülmasse nach
einer Reinigung durch Gelfiltration.
-
2.
Antiproliferative Effekte eines durch das diskontinuierliche DEAE-Reinigungsverfahren
gereinigten Materials (was mit den Peaks 1 und 2 der 1 im
Wesentlichen übereinstimmt),
gemessen durch die tritiummarkierte Thymidinaufnahme.
-
3.
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese der Fraktion von hoher Molekülmasse nach
einer Gelfiltration und DEAE-Reinigung.
-
4.
Wirkung einer Fraktion von hoher Molekülmasse auf eine HIV-1-Infektion
von HeLa P4, wobei die Prozente infizierte Zellen (quadratische
Datenpunkte) und die Prozente lebende Zellen (diamentförmige Datenpunkte)
als Funktion der Inverse (1/x) der Extraktverdünnung dargestellt sind.
-
5.
Wirkung einer Fraktion von hoher Molekülmasse auf die Wucherung von
Krebszelllinien in vitro, gemessen durch den tritiummarkierten Thymidineinbau
als Funktion der vorhandenen Proteinmenge (Mikroliter Extrakt pro
Milliliter Kulturmedium).
-
6A–B. Wirkung
einer Fraktion von hoher Molekülmasse
auf die Wucherung der menschlichen MDA-MB-435-Brustkrebszelllinie
in vitro, gemessen durch den tritiummarkierten Thymidineinbau als
Funktion (6A) des Volumens an verabreichtem
Extrakt und (6B) der vorhandenen Proteinmenge
(Mikroliter Extrakt pro Milliliter Kulturmedium).
-
7A–B. Wirkung
einer Fraktion von hoher Molekülmasse
auf die Wucherung der menschlichen H460-Lungenkrebszelllinie in
vitro, gemessen durch den tritiummarkierten Thymidineinbau als Funktion (7A)
des Volumens an verabreichtem Extrakt und (7B) der
vorhandenen Proteinmenge (Mikroliter Extrakt pro Milliliter Kulturmedium).
-
8.
Kombinatorisches Peptidgemisch, gelaufen durch eine Phenomenex-C5-Umkehrphasensäule. Der
Durchsatz betrug 1 ml/min. Puffer A = 0,1 Prozent Trifluoressigsäure in H2;
Puffer B = 0,1 Prozent Trifluoressigsäure in 99,9 Prozent Acetonitril.
Ein linearer Gradient von 0 Prozent B auf 100 Prozent B in 200 Minuten
wurde ausgeführt.
Peaks wurden bei 220 nm überwacht.
-
9.
Resultate eines MCF-Assays, der unter Verwendung getrennter Peptide
aus 1 durchgeführt
wurde. Die x-Achse stellt cpm dar und spiegelt dabei die durch wuchernde
Zellen aufgenommene Radioaktivität
wider.
-
10A. HPLC-Chromatogramm, wobei durch DEAE-Chargen
gereinigtes Material an einer mit PBS eluierten Progel TSK G2000-Gelfiltrationssäule (Supelco)
weiter gereinigt wird.
-
10B. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese eines
Materials in gemäß 10A gereinigten aktiven Fraktionen.
-
5. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
-
Zum
Zwecke der Klarheit und nicht als Einschränkung wird die detaillierte
Beschreibung der Erfindung in die folgenden Unterabschnitte geteilt.
- (a) Isolierung von Proteinfraktionen eines
Embryonalextrakts, welche hohe und geringe Molekülmassen aufweisen;
- (b) antivirale, antiproliferative Proteine aus den Fraktionen
von hoher Molekülmasse;
und
- (c) antiproliferative Peptide aus den Fraktionen von geringer
Molekülmasse.
-
5.1. ISOLIERUNG VON PROTEINFRAKTIONEN
EINES EMBRYONALEXTRAKTS, WELCHE HOHE UND GERINGE MOLEKÜLMASSEN
AUFWEISEN
-
Ein
Embryonalextrakt kann durch Solubilisierung (Homogenisierung und/oder
Bildung eines Zelllysats) eines Säugetierembryogewebes, einschließlich eines
menschlichen, Schweine-, Rinder-, Pferde-, Schaf- oder Ziegenembryogewebes,
ohne darauf beschränkt
zu sein, hergestellt werden, welches den gesamten Embryo oder einen
Teil davon, zum Beispiel, aber nicht einschränkend die Leber oder das Gehirn
des Embryos, darstellen kann. Der Embryo oder das Gewebe kann durch
jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren homogenisiert und/oder
zur Bildung eines Zelllysats verwendet werden, einschließlich der
Verwendung eines Janke-und-Kinkel-Gewebehomogenisators Modell T-45,
eines Dounce-Gewebehomogenisators
oder durch Beschallung, ohne darauf beschränkt zu sein. Zellbruchstücke können dann
z. B. durch 30-minütige
Zentrifugation bei 18.000 U/min entfernt werden, um einen überstehenden
Extrakt zu bilden. Fraktionen von hoher und geringer Molekülmasse können wie
nachstehend dargelegt aus dem Extrakt hergestellt werden.
-
Die
Fraktion von hoher Molekülmasse
kann erhalten werden, indem der überstehende
Extrakt einer Gelfiltration unterzogen wird und jene Fraktionen
gesammelt werden, die antiproliferative Aktivität aufweisen, wobei solche Fraktionen
Protein umfassen, das Molekülmassen
von mehr als 5 kDa, vorzugsweise mehr als 10 kDa und noch bevorzugter
mehr als 30 kDa aufweist. Bei spezifischen, nicht einschränkend gedachten
Ausführungsformen
kann die Fraktion von hoher Molekülmasse hergestellt werden,
indem der Embryoextrakt durch eine Sephacryl-S-100-Gelfiltrationssäule fraktioniert
wird. Wenn die Säule
eine 750 ml-Säule
ist, ist der Elutionspuffer 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM Dithiothreitol
(DTT), und 4 ml-Fraktionen werden gesammelt, die Spezien von höherer Molekülmasse können typischerweise
aus den Fraktionen 40–60
erhalten werden. Ein nicht einschränkend gedachtes Beispiel eines
Protokolls, das zum Reinigen eines antiviralen/antiproliferativen Proteins
verwendet werden kann, ist nachstehend in den Abschnitten 6 und
8 dargelegt.
-
Die
eine höhere
Molekülmasse
aufweisenden Fraktionen aus der Gelfiltrationssäule können hinsichtlich ihrer antiproliferativen
Wirkung auf Brustkrebszellen der MCF-7-Zelllinie bewertet werden. Fraktionen,
die antiproliferative Aktivität
aufweisen, können
hinsichtlich ihrer antiviralen Wirkung genutzt oder weiter gereinigt werden.
-
Um
eine höhere
Reinigung zu erzielen, können
die aktiven Fraktionen von höherer
Molekülmasse
zum Beispiel gepoolt, beim pH-Wert z. B. auf einen pH von etwa 8,5
eingestellt und auf eine HPLC-DEAE-Ionenaustauschersäule aufgebracht
und mit einem linearen Gradienten von 0–1 M NaCl eluiert werden, und
die Fraktionen, die eine antiproliferative Wirkung auf MCF-7-Zellen
aufweisen, können
gesammelt werden. Ein Beispiel eines solchen Chromatogramms ist
in 1 dargestellt. Eine antiproliferative Wirkung
ist als Abnahme der Zellwucherung um mindestens 30 Prozent definiert.
-
Eine
noch weitere Reinigung kann erzielt werden, indem DEAE-gereinigtes
Material (unter Verwendung entweder einer Säule oder des untenstehend beschriebenen
Chargenverfahrens) einer Kationenaustauschchromatographie an einer
TSK-Gel-CM-3SW-Säule
unterzogen wird. Von der Säule
gesammelte Fraktionen, die antiproliferative/antiinfektiöse Aktivität aufweisen,
können
durch Messung der Hemmung der MCF-7-Wucherung identifiziert werden.
-
Ein
bevorzugtes Verfahren zum Erzielen einer höheren Reinigung eines Materials,
das bereits durch Gelfiltration gereinigt wurde, ist ein Chargenverfahren,
bei dem ein Ionenaustauscherharz, wie z. B. DEAE, verwendet wird.
Da, wie in 1 zu sehen, die meiste antiproliferative
Aktivität
in frühen
Fraktionen (Peaks 1 und 2 in 1) lokalisiert
ist, bewirkt eine Chargenreinigung eine wirksame Reinigung und kann
bei größeren Probenmengen
durchgeführt
werden. Um das Chargenreinigungsverfahren durchzuführen, können Fraktionen von
höherer
Molekülmasse
aus einer Gelfiltrationsreinigung (wobei es sich um 50 mM Tris-HCl
handelt) gepoolt werden, und der pH-Wert der gepoolten Fraktionen
kann mit NaOH auf einen pH von etwa 8,5 eingestellt werden. DEAE-Harz
kann voräquilibriert
werden, indem es in 50 mM Tris-HCl, pH 8,5-Puffer bei einem 2:1-Verhältnis von
Puffervolumen zu Harzvolumen eingeweicht wird, das Harz sich setzen
gelassen wird, überschüssiger Puffer
abgegossen wird, und zwar mindestens zweimal und bis der pH-Wert
des überstehenden
Puffers etwa 8,5 beträgt.
Das DEAE kann dann in einem groben Sintertrichter gegen ein Vakuum,
bis das Harz gerade trocken ist, gesammelt und gewogen werden. Das
DEAE-Harz kann mit den gepoolten Fraktionen von hoher Molekülmasse (wobei
es sich um 50 mM Tris-HCl mit einem pH von etwa 8,5 handelt) in
einem Verhältnis
von 1 Gramm Harz zu 5 ml gepooltem Fraktionsmaterial kombiniert
und bei 4°C
zwischen 1 und 24 Stunden lang vermischt werden. Der resultierende
Harzschlamm kann dann durch einen groben Sintertrichter geleitet
werden, wo die gesammelte Lösung
gereinigte aktive Probe enthält,
und das Harz kann verworfen oder regeneriert werden. Vorzugsweise
kann die resultierende Lösung
vor der Verwendung zum Beispiel durch einen Millex-0,2 μ-Spritzenfilter
filtersterilisiert und gefroren gelagert werden. Beispiele für die antiproliferative
Aktivität
eines durch das Chargenreinigungsverfahren gereinigten Materials
werden in 2 gezeigt. 3 zeigt
die Resultate einer SDS-Polyacrylamidgel (SDS-PAGE)-Elektrophorese von Fraktionen
von hoher Molekülmasse,
die durch Gelfiltration und DEAE-Reinigungsverfahren gereinigt wurden.
Eine weitere Reinigung kann beispielsweise durch Umkehrphasenchromatographie,
präparative
Gelelektrophorese oder durch Präzipitations-
oder Affinitätschromatographie
unter Verwendung von Antikörpern,
die speziell auf embryonale Proteine gerichtet sind, erzielt werden.
Bei einer spezifischen, nicht einschränkend gedachten Ausfährungsform
der Erfindung kann eine weitere Reinigung erzielt werden, indem
ein durch eine diskontinuierliche DEAE-Behandlung gereinigtes Material
beispielsweise mit Hilfe eines CentriplusTM (Rückhaltevermögen von
3 kDa, Amicon, Inc., Beverly MA) konzentriert und das Konzentrat
auf eine Progel-TSK-G2000-Gelfiltrationssäule (Supelco)
aufgebracht wird, die dann mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)
eluiert und als Fraktionen gesammelt wird. Ein Beispiel eines HPLC-Chromatogramms des
Materials wird in 10A gezeigt. Antiproliferative
Aktivität
wurde in einem Peak mit einer Retentionszeit von 16,021 Minuten
festgestellt, welcher Proteine mit einer Molekülmasse im Bereich von 30–50 kDa
umfasste und mit den Fraktionen 15–18 am Chromatogramm übereinstimmte.
Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese eines Materials in diesen
Fraktionen erbrachte mehrere gut aufgelöste Proteinbanden (10B) bei Molekülmassen
von ungefähr
80–90
kDa, 50–60
kDa und 40–42 kDa.
-
Die
Fraktion von geringer Molekülmasse
kann erhalten werden, indem das Embryohomogenat durch eine Sephacryl-S-100-Gelfiltrationssäule fraktioniert
wird. Wenn die Säule
eine 750 ml-Säule
ist, ist der Elutionspuffer 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM Dithiothreitol
(DTT), und 4 ml-Fraktionen werden gesammelt, die Spezien von geringer
Molekülmasse
können
typischerweise aus den Fraktionen 100–110 erhalten werden. Ein nicht
einschränkend
gedachtes Beispiel eines Protokolls, das zum Reinigen des antiviralen
Proteins verwendet werden kann, ist nachstehend in Abschnitt 8 dargelegt.
Die eine geringe Molekülmasse
aufweisenden Fraktionen von der Gelfiltrationssäule können dann gepoolt, lyophilisiert,
in Wasser wiederhergestellt und auf eine C18-Umkehrphasen-HPLC-Säule aufgebracht
werden. Danach kann Material unter Verwendung eines Zweikomponenten
(A/B)-Puffersystems aus der Säule
eluiert werden. Puffer A kann 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser
sein; Puffer B kann 0,1% Trifluoressigsäure in 99,9% Acetonitril sein.
Die Säule
kann mit einem linearen Gradienten von 0–100% Puffer B innerhalb 1
Stunde entwickelt werden. Danach können Fraktionen gesammelt und
im MCF-7-Assay hinsichtlich der biologischen Aktivität untersucht
werden, und aktive Fraktionen können
gesammelt und gepoolt werden.
-
5.2. ANTIVIRALE, ANTIPROLIFERATIVE PROTEINE
AUS DER FRAKTION VON HOHER MOLEKÜLMASSE
-
Die
vorliegende Offenbarung stellt ein antiproliferatives/antivirales
Protein bereit, wie es in der obenstehend beschriebenen, eine hohe
Molekülmasse
aufweisenden Fraktion eines Embryonalextrakts enthalten ist. Demgemäß stellt
die vorliegende Offenbarung therapeutische Zusammensetzungen bereit,
die ein oder mehrere antiproliferative Proteine umfassen, wie sie
in einer eine hohe Molekülmasse
aufweisenden Fraktion eines Embryonalextrakts enthalten sind, welcher
durch die folgenden Schritte hergestellt wird: a) das Solubilisieren
eines Säugetier-Embryonalgewebes;
b) das Zentrifugieren des solubilisierten Embryonalgewebes, um einen Überstand
zu bilden; c) das Aufbringen des Überstands auf eine Gelfiltrationssäule; d)
das Eluieren der Gelfiltrationssäule;
e) das Sammeln des Eluats als serielle Fraktionen; und f) das Identifizieren
einer oder mehrerer Fraktionen, die Protein mit einer Molekülmasse von
mehr als 5 kDa, vorzugsweise mehr als 10 kDa und noch bevorzugter
mehr als 30 kDa enthalten und die Wucherung einer Krebszelle hemmen.
Die vorliegende Offenbarung stellt insbesondere antiproliferative/antivirale
Zusammensetzungen bereit, die ein oder mehrere solche Proteine umfassen,
die eine Molekülmasse
von 4–8
kDa, 10–12
kDa, 14–18
kDa oder 30–80
kDa, insbesondere von 40–70
kDa und im Speziellen von 40–50
kDa oder 60–70
kDa, aufweisen. Das Protein kann eine Molekülmasse von ungefähr 80–90 kDa,
50–60
kDa, 40–42
kDa, 20,1 kDa, 10821 Da, 14832 Da, 14987 Da, 5411 Da oder 7477 Da
aufweisen. Dass dieses Protein antiproliferative und/oder antivirale
Aktivität
aufweist, kann zum Beispiel, aber nicht einschränkend in einem Assay demonstriert
werden, bei dem MCF-7-Brustkrebszellen verwendet werden, wobei die
Wucherung um mindestens 30 Prozent und vorzugsweise um mindestens
75 Prozent gehemmt wird, oder in einem Assay, bei dem das Affen-Rotavirus
verwendet wird, wobei der cytopathische Effekt um mindestens 30
Prozent und vorzugsweise um mindestens 50 Prozent vermindert wird.
Diese Zusammensetzungen können
weiters einen geeigneten pharmazeutischen Träger und gegebenenfalls einen
oder mehrere zusätzliche
bioaktive Wirkstoffe umfassen.
-
Der
gereinigte antivirale Wirkstoff bzw. die gereinigten antiviralen
Wirkstoffe der Fraktion von hoher Molekülmasse kann bzw. können verwendet
werden, um Zellen vor einer Virusinfektion zu schützen und/oder pathologische
Effekte abzuschwächen,
wenn eine Infektion stattgefunden hat. Die antiviralen Effekte können in
vitro oder in vivo hervorgerufen werden. Die Zusammensetzungen können somit
verwendet werden, um die Auswirkungen einer Infektion bei einem
eine solche Behandlung benötigenden
Patienten zu verhindern oder abzuschwächen.
-
Der
Wirkstoff bzw. die Wirkstoffe kann bzw. können als antivirale(r) Wirkstoff(e)
gegen eine Infektion durch DNA- und RNA-Viren, einschließlich Mitgliedern
der Bunyavirus-, Togavirus-, Reovirus-, Herpesvirus- und Pockenvirus-Familie,
wie obenstehend dargelegt, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein,
sowie doppelsträngige
DNA-Viren, wie z. B. die Papovaviren (einschließlich des Polyoma-, des SV40-
und des Papillomavirus), Adenoviren und Oridoviren; einzelsträngige DNA-Viren,
wie z. B. die Parvoviren (einschließlich des Adeno-assoziierten
Virus, des Minute-Virus bei Mäusen,
des Parvovirus bei Hund, Katze und Mensch); positivsträngige RNA-Viren,
wie z. B. die Picornaviren (einschließlich des Polio-, des Erkältungs-,
des Maul- und Klauenseuchen- und des Enterovirus) und die Coronaviren
(einschließlich
erkältungsähnlicher
Erkrankungen beim Menschen und des Maus-Hepatitis-Virus): negativsträngige RNA-Viren,
wie z. B. die Rhabdoviren (einschließlich des Tollwut- und des
vesikulären
Stomatitis-Virus), die Paramyxoviren (einschließlich des Newcastle-Disease-,
des Maser-, des Mumps-, des RS- und
des Sendai-Virus), die Orthomyxoviren (wie z. B. Influenzaviren)
und die Arenaviren (einschließlich
des Lassa-Virus und des lymphozytären Choriomeningitis-Virus); RNA → DNA-Viren,
wie z. B. Retroviren (einschließlich
der humanen Immundefizienzviren Typ 1 und 2, des Vogel-, Katzen-
und Maus-Leukämievirus
und des Maus-Mammatumorvirus) und DNA → RNA-Viren, wie z. B. das Hepadnavirus
(einschließlich
des Hepatitis-B-Virus),
ohne darauf beschränkt
zu sein, verwendet werden.
-
Der
gereinigte antiproliferative Wirkstoff bzw. die gereinigten antiproliferativen
Wirkstoffe der Fraktion von hoher Molekülmasse kann bzw. können verwendet
werden, um Zellen vor einer malignen Transformation zu schützen oder
die Wucherung bösartiger
Zellen zu vermindern. Die antiproliferativen Effekte können in
vitro oder in vivo hervorgerufen werden. Bei besonderen Ausführungsformen
kann der antiproliferative Wirkstoff bzw. können die antiproliferativen
Wirkstoffe der Fraktion von hoher Molekülmasse verwendet werden, um
Karzinome, welche Brust, Lunge, Prostata, Knochen, Leber, Lymphozyten,
Plattenepithel, Melanozyten, Kolon, Magen, Bauchspeicheldrüse, Speiseröhre, Haut,
Hoden und Nervensystem betreffen, zu behandeln und deren Wucherung
zu verhindern und/oder zu hemmen. Es wurde nachgewiesen, dass der
Wirkstoff bzw. die Wirkstoffe der Fraktion von hoher Molekülmasse in
vitro die Wucherung von menschlichen Brust- und Lungenkrebszellen,
lymphoblastischen und promyelozytischen Leukämiezellen, des nicht kleinen
Lungenzellen-Zellkarzimoms (Linie NCIH226), von Kolonkrebszellen
(Linien COLO205, SW620), Zentralnervensystemzellen (SF-539) und
Melanomzellen (Linien SK-MEL 28 und SK-MEL 5) hemmt bzw. hemmen.
Die Zusammensetzungen können
somit verwendet werden, um das Wachstum oder die Ausbreitung bösartiger
Zellen bei einem eine solche Behandlung benötigenden Patienten zu verhindern
oder zu hemmen.
-
5.3. ANTIPROLIFERATIVE PEPTIDE AUS DER
FRAKTION VON GERINGER MOLEKÜLMASSE
-
Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf Zusammensetzungen, die eines
oder mehrere der folgenden gereinigten und isolierten Heptapeptide
umfassen, und auf Peptide und Proteine, welche die folgenden Peptide
umfassen.
Cys Val His Ala Tyr Arg Ser (SEQ ID NO:1);
Cys
Val His Ala Tyr Arg Ala (SEQ ID NO:2);
Cys Val His Ala Phe
Arg Ser (SEQ ID NO:3);
Cys Val His Ala Phe Arg Ala (SEQ ID
NO:4);
Cys Val His Ser Tyr Arg Ser (SEQ ID NO:5);
Cys
Val His Ser Tyr Arg Ala (SEQ ID NO:6);
Cys Val His Ser Phe
Arg Ser (SEQ ID NO:7);
Cys Val His Ser Phe Arg Ala (SEQ ID
NO:8);
Cys Val His Thr Tyr Arg Ser (SEQ ID NO:9);
Cys
Val His Thr Tyr Arg Ala (SEQ ID NO:10);
Cys Val His Thr Phe
Arg Ser (SEQ ID NO:11); und
Cys Val His Thr Phe Arg Ala (SEQ
ID NO:12).
-
Bei
bevorzugten Ausführungsformen
umfassen die erfindungsgemäßen Peptide
und Proteine Peptide, die Sequenzen aufweisen, wie in SEQ ID NOS
2, 3 und 8 dargelegt.
-
Solche
Peptide können
auch durch Konjugation mit einer anderen Verbindung modifiziert
werden, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, die
andere Proteine (z. B. Immunglobulinmoleküle oder Fragmente davon), Kohlenhydratreste,
pharmazeutische Wirkstoffe, Polyethylenglykol, etc. umfasst, ohne
darauf beschränkt
zu sein, oder können
in ein größeres Peptid
oder Protein, z. B. ein Fusionsprotein, eingebaut werden.
-
Die
vorliegende Offenbarung stellt isolierte Nucleinsäuren bereit,
welche die Peptide SEQ ID NO: 1–12 codieren.
Solche Peptide können
in einem geeigneten Vektor für
die Klonierung und/oder Expression enthalten sein.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt auch Peptide, wie obenstehend dargelegt,
bereit, welche hergestellt werden, indem ein kombinatorisches Gemisch
aus jedem der möglichen
Peptide erzeugt und die Mischung einer Umkehrphasenchromatographie
unterzogen wird, wie nachstehend dargelegt und in 8 dargestellt
ist. Fraktionen, die an Positionen wandern, welche in 8 als
Peaks A, F und K dargestellt sind, werden für die Verwendung als antiproliferative
Wirkstoffe besonders bevorzugt.
-
Die
erfindungsgemäßen Peptide
können
aus natürlichen
Quellen hergestellt, chemisch synthetisiert oder durch rekombinante
DNA-Verfahren hergestellt werden. Die vorliegende Offenbarung stellt
auch das Einbringen einer Nucleinsäure in ein Subjekt bereit,
wobei die Nucleinsäure
eines oder mehrere der vorhergehenden Peptide codiert, die mit einem
Promotorelement betriebsfähig
verbunden sind, so dass das codierte Peptid oder die codierten Peptide
exprimiert wird bzw. werden. Das Subjekt kann ein Mikroorganismus,
wie z. B. ein Bakterium oder Hefe, eine Eukaryontenzelle, wie z.
B. eine Säugetier-,
Insektenoder Pflanzenzelle, oder ein vielzelliger Organismus, wie
z. B. ein Säugetier
oder ein Vogel, sein.
-
Die
erfindungsgemäßen antiproliferativen
Peptide können
bei Verfahren zum Hemmen einer Zellwucherung und insbesondere zum
Hemmen einer bösartigen
Zellwucherung verwendet werden. Sie können einem eine solche Behandlung
benötigenden
Patienten in einer wirksamen Dosis und in einem geeigneten pharmazeutischen
Träger
verabreicht werden. Die Verabreichungsmethoden umfassen die topische,
intravenöse, orale, intrapulmonale,
intrathekale, subkutane, intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale
Verabreichung sowie die lokale Injektion in ein Gewebe oder einen
Tumor, ohne darauf beschränkt
zu sein. Proliferative Zustände,
die von der Verabreichung erfindungsgemäßer Peptide profitieren können, umfassen,
ohne darauf beschränkt
zu sein, Karzinome, einschließlich
Brustkrebs, Prostatakrebs, Kolonkrebs, Lungenkrebs, Karzinomen des
Magens, der Haut, des Gehirns, der Muskeln, der Bauchspeicheldrüse, der
Leber und der Blase, ohne darauf beschränkt zu sein; und gutartige
proliferative Zustände,
wie z. B. Neoplasmen, wie z. B. Brustadenome und eine übermäßige Wucherung
von Geweben, wie sie bei rheumatoider Arthritis und Keloidbildung
auftritt.
-
Die
Peptide der Offenbarung können
als antiinfektiöse
Wirkstoffe verwendet werden. Sie können als solche verwendet werden,
um die Vermehrung von Viren und insbesondere von Viren wie z. B.
dem Influenzavirus, Vacciniavirus und humanen Immundefizienzvirus
zu hemmen.
-
6. BEISPIEL: ANTIVIRALE WIRKUNGEN VON
EMBRYONALEN PROTEINEN
-
6.1. MATERIALIEN UND VERFAHREN
-
6.1.1. HERSTELLUNG EINES GEREINIGTEN EMBRYONALEN
PROTEINS BZW. VON GEREINIGTEN EMBRYONALEN PROTEINEN
-
Fünf Gramm
aus Schweineembryos geerntete Leber wurden bei 4°C in Extraktionspuffer (50 mM
Tris, pH 7,5; 1 mM PMSF; 1 mM Benzamidin, 10 μg/ml Pepstatin und 1 mM DTT;
wobei das Extraktionspuffervolumen/Leber-Gewichtsverhältnis 3:1
betrug) mit Hilfe eines Janke-und-Kinkel-Gewebehomogenisators Modell T-45
1 Minute lang homogenisiert. Das Homogenat wurde dann bei 18.000
U/min in einer Beckman-J2-21-Zentrifuge 30 Minuten lang zentrifugiert.
Das Pellet wurde verworfen, und der Überstand wurde auf eine 750
ml-Sephacryl-S-100-Säule
(Pharmacia) aufgebracht und bei 4°C
mit 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM DTT eluiert. Fraktionen, die etwa
4 ml enthielten, wurden gesammelt, mittels Filtration durch 0,2 μm-Filter
(Millex) sterilisiert und mittels des obenstehend beschriebenen
MCF-7-Assays analysiert. Aktives Material wurde gepoolt und bei –80°C gelagert.
Aktive Fraktionen, die Spezien von hoher Molekülmasse enthielten (etwa Fraktionen
40–60), wurden
bei den nachstehenden Versuchen verwendet.
-
6.1.2. VIREN
-
Die
folgenden Viren wurden verwendet: San Angeln (SAV, ein Mitglied
der Bunyaviridae-Familie), ursprünglicher
Stamm, erhalten von der American Type Culture Collection (ATCC,
Rockville, MD); venezolanische Pferdeenzephalitis (VEE, ein Mitglied der
Togaviridae-Familie), Stamm Trinidad (TC-abgeschwächt), erhalten
von der ATCC; Affen-Rotavirus (SRV, ein Mitglied der Reoviridae-Familie),
Stamm SA11, erhalten von Dr. Mary Estes, Baylor College of Medicine,
Houston, TX; Typ 1-Herpes (HSV-1, ein Mitglied der Herpesviridae-Familie),
Stamm McKrae, bereitgestellt von Dr. A. B. Nesburne von der Estelle
Doheny Eye Foundation, Los Angeles, CA; und Vacciniavirus (VV, ein
Mitglied der Poxviridae-Familie), Stamm Lederle chorioallantoic, erhalten
von der ATCC. Ein Pool eines jeden Virus wurde in den geeigneten
Zellkulturen hergestellt, in Ampullen gefüllt, bei –80°C gefroren und vor der Verwendung
in dieser Untersuchung in vitro titriert.
-
6.1.3. ZELLEN UND MEDIEN
-
Der
SAV-Test wurde an Nieren (Vero)-Zellen der afrikanischen grünen Meerkatze
durchgeführt,
wobei minimales essentielles Medium (MEM) mit 0,1% NaHCO3 und 5% fötalem Rinderserum (FBS) und
MEM + 2% FBS, 0,1% NaHCO3 und 50 μg/ml Gentamicin
beim Antivirustest als Wachstumsmedium verwendet wurden. Eine Untersuchung
hinsichtlich VEE wurde bei MA104-Zellen durchgeführt, und zwar mit demselben
Medium, wie obenstehend hinsichtlich des Zellwachstums beschrieben,
und mit MEM + 0,18% NaHCO3 und 50 μg/ml Gentamicin
ohne FBS für
den Antivirustest. Der SRV-Test wurde ebenfalls mit demselben Medium,
wie obenstehend hinsichtlich VEE beschrieben, unter Hinzufügung von
2 μg/ml
Trypsin an MA104-Zellen durchgeführt. Die
HSV-1-Tests wurden unter Verwendung der menschlichen embryonalen
Lungenzelllinie MRC-5 durchgeführt,
wobei es sich bei dem Wachstumsmedium um Basal Medium Eagle (BME),
10% FBS, 0,035% NaHCO3 und bei dem antiviralen
Testmedium um MEM mit 2% FBS, 0,18% NaHCO3 und
50 μg/ml
Gentamicin handelte. VV-Tests wurden an Zellen (CV-1) der afrikanischen
grünen
Meerkatze durchgeführt,
wobei es sich bei dem Wachstumsmedium um MEM, 10% FBS und 0,05%
NaHCO3 und bei dem Testmedium um MEM + 2%
FBS und 50 μg/ml
Gentamicin handelte.
-
6.1.4. POSITIVE KONTROLLEN
-
Die
folgenden Verbindungen wurden als positive Kontrollen verwendet,
die mit den passenden Tests durchgeführt wurden: Acyclovir (Glaxo-WellcomE,
Research Triangle Park, NC), Cidofovir (Gilead Sciences, Foster
City, CA) und Ribavirin (ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA). Jede
wurde in den nachstehend angeführten
Konzentrationen in einem Zellkulturmedium zur Verwendung bei dieser
Untersuchung aufgelöst.
-
6.1.5. MESSUNG DES VIRALEN CYTOPATHISCHEN
EFFEKTS
-
Der
antivirale Effekt wurde als Verminderung des virusinduzierten cytopathischen
Effekts (CPE) gemessen. Sieben 1/2-log10-Verdünnungen
von gereinigtem embryonalem Protein, beginnend mit einer Verdünnung von
1:5, und das passende bekannte positive Kontrollarzneimittel in
vorbestimmten Konzentrationen und einem Volumen von 0,1 ml wurden
auf die geeignete 24-Stunden-Zellmonoschicht in 96-Mulden-Mikroplatten mit
flachem Boden gegeben. Nach ungefähr 5 Minuten wurde das Testvirus
in einem Volumen von 0,1 ml zu den Zellen hinzugefügt, wobei
4 Mikroplattenschalen/Proteinverdünnung verwendet wurden. Die
Toxizitätskontrollmulden
(2 Schalen/Arzneimittelkonzentration) erhielten 0,1 ml Testmedium;
die Viruskontrollmulden (8 Mulden) wurden dem Testmedium und dem
Virus ausgesetzt, und die normalen Kontrollmulden (4 Mulden) erhielten
nur das Testmedium. Jede Mikroplatte enthielt die Tests sowohl für Protein
als auch das positive Kontrollarzneimittel. Die Mikroplatten wurden
mit einer Plastikhülle
versiegelt und in einem angefeuchteten Inkubator bei 37°C inkubiert,
bis der durch eine mikroskopische Untersuchung der Platte bestimmte
CPE beinahe maximale (3–4+)-Pegel
erreicht hatte. Die Mikroplatten wurden dann von einem für eine solche
Zelluntersuchung ausgebildeten Techniker untersucht, und jeder Virus
enthaltenden Schale wurden Virus-CPE-Punktezahlen von 0 (normal)
bis 4 (maximaler CPE) zugeordnet. Die Toxizität wurde auch mikroskopisch
bestimmt, wobei dem Grad der Toxizität, die durch ein abweichendes
Zellerscheinungsbild nachgewiesen wurde, Punktezahlen im Bereich
von 20%-Stufen zugeordnet wurden. Die CPE-Inhibitionsdaten wurden
gegen eine Proteinverdünnung
aufgetragen, und zum Bestimmen einer 50%igen effektiven (Virus-CPE-hemmenden)
Dosis (EC50) wurde eine Ausgleichsgerade eingesetzt. Die Toxizitätsdaten
wurden gleichermaßen
aufgetragen, um eine 50%ige zytotoxische (zellhemmende) Konzentration
(CC50) zu bestimmen. Ein Selektivitätsindex (SI) wurde als CC50 ÷ EC50
festgelegt. Die positiven Kontrollverbindungen waren für SAV, VEE
und SRV Ribavirin; für
HSV-1 Acyclovir; und für
VV Cidofovir (HPMPC). Dieses Verfahren wurde zuvor bei Sidwell und
Huffman, 1971, Appl. Microbiol. 22: 797–801; Sidwell, et al. 1972,
Science 177: 705–706;
Barnard, et al., 1993, Chemotherapy 39: 203–211; Huffman, et al., 1997,
Antiviral Chem. and Chemother. 8: 75–83; und Barnard, et al., 1997,
Anti. Chem. and Chemother. 8: 223–233, beschrieben.
-
6.1.6. NEUTRALROT-ASSAY
-
Die
obigen CPE-Hemmtests wurden durch Hinzufügung eines neutralen roten
Farbstoffs zu den Zellen validiert; die nicht vom Virus geschädigten Zellen
nehmen eine größere Menge
an Farbstoff auf, was an einem computergesteuerten Mikroplatten-Autoreader abgelesen
wird. Dieses Verfahren wurde bei Barnard et al., 1993, Chemotherapy
39: 203–211;
Huffman et al., 1997, Antiviral Chem. and Chemother. 8: 75–83; Barnard
et al., Anti. Chem. and Chemother. 8: 223–233, vollständig beschrieben.
EC50, CC50 und SI wurden wiederum durch das Farbstoffaufnahmeverfahren
bestimmt.
-
6.2. ERGEBNISSE UND ERÖRTERUNG
-
Die
Ergebnisse der Tests mit SAV, SRV, HSV-1 und VV werden in den nachstehenden
Tabellen I–V gezeigt.
-
Das
embryonale Protein war gegenüber
SAV (Tabelle I) mäßig hemmend,
und zwar mit einer EC50 von 7,7% (Neutralrot) und 12,5% (visuelles
CPE-Verfahren). Die Verbindung verursachte bei der höchsten getesteten
Dosis nur eine leichte Zytotoxizität von 20%, so dass keine CC50
bestimmt werden konnte. Ribavirin übte die zuvor beobachtete positive
Aktivität
aus; wir kennen keine veröffentlichten
Berichte über
die Wirksamkeit von Ribavirin gegenüber SAV, obwohl berichtet wurde,
dass die verwandten Bunyaviridae-Viren Hantaan (Kirsi et al., 1983,
Antimicrob. Ag. Chemother. 24: 353–361), La Crosse (Cassidy und
Patterson, 1989, Antimicrob. Ag. Chemother. 33: 2009–2013),
Punta Toro (Sidwell et al., 1988, Antimicrob. Ag. Chemother. 32: 331–336; Huffman
et al., 1989, Nucleotides and Nucleosides 8: 1159–1160) und
Rifttalfieber (Stephen et al., 1980, in "Ribavirin: A Broad-Spectrum Antiviral Agent", (Smith und Kirkpatrick,
Hrsg.), Academic Press, NY, S. 169–183) auf diese Verbindung
empfindlich reagierten.
-
SRV
(Tabelle II) wurde von embryonalem Protein ebenfalls mäßig gehemmt,
wobei die EC50-Werte so niedrig wie 1,6% waren. Ein CC50-Wert von
11% wurde beobachtet, als diese Verbindung bei MA-104-Zellen eingesetzt
wurde, wobei eine visuelle Untersuchung der Zellen zur Anwendung
kam, bei Aufnahme eines neutralen roten Farbstoffs war jeglicher
zytotoxischer Effekt, der zu sehen war, jedoch minimal. Ribavirin
war gegenüber
diesem Virus schwach wirksam; diese Wirksamkeit lag in dem zuvor
berichteten Bereich (Smee et al., 1981, Proc. Intl. Conf. On Neonatal
Diarrhea Vet. Inf. Dis. Org., Saksatoon, S. 123–136).
-
Eine ähnliche
antivirale Aktivität
wurde gegenüber
HSV-1 beobachtet (Tabelle III), wobei die EC50-Werte bei 10–12% lagen,
und zwar ohne nachweisbare CC50. Acyclovir, das als positives Kontrollarzneimittel
eingesetzt wurde, übte
die erwartete Aktivität
aus, wie von anderen berichtet wurde (Elion, 1982, Am. J. Med. 73:
7–13).
-
Bei
einer visuellen Zelluntersuchung war keine Wirksamkeit gegenüber VV erkennbar
(Tabelle IV), bei dem Test durch Aufnahme eines neutralen roten
Farbstoffs wurde jedoch eine EC50 von 8,4% beobachtet. Bei den CV-1-Zellen
wurde eine visuelle CC50 von 11% beobachtet, dies konnte jedoch
durch eine Neutralrot-Aufnahme nicht bestätigt werden. Dieser Unterschied
in den Ergebnissen der Zytotoxizität ist nicht ungewöhnlich, da
eine visuelle Untersuchung geringe, die Wirkung des Testarzneimittels
kennzeichnende Zellveränderungen nachweisen
kann, die Zellen jedoch ausreichend lebensfähig bleiben, um den Farbstoff
in einer normalen Art und Weise aufzunehmen. Cidofovir (HPMPC) war
gegenüber
VV wirksam; wir kennen keine Berichte über die in vitro-VV-hemmenden
Wirkungen dieser Verbindung, über
eine starke Wirksamkeit gegenüber
der Infektion bei Mäusen
wurde jedoch berichtet (Neyts und DeClerq, 1993, J. Med. Virol.
41: 242–246).
-
Die
Aktivität
des embryonalen Proteins gegenüber
VEE (Tabelle V) ähnelte
dessen Aktivität
gegenüber
den anderen Viren, obwohl bei einer Versuchsreihe beobachtet wurde,
dass einige Zellen während
der Spülschritte
des Neutralrot-Assays von der Platte gewaschen wurden.
-
Jedes
bei diesen Versuchen verwendete Virus ist für die öffentliche Gesundheit von wesentlicher
Bedeutung oder ist mit Viren verwandt, die eine solche Bedeutung
haben.
-
Bunyaviren
verursachen eine Reihe von Erkrankungen, einschließlich des
Rifttalfiebers, des Sandfliegen-Fiebers und des hämorrhagischen
Krim-Kongo-Fiebers. Die Togaviren, die von Bedeutung sind, umfassen insbesondere
VEE, aber auch eine Reihe von anderen Enzephalitisviren, wie z.
B. das östliche
und das westliche Pferdeenzephalitis-Virus und das Chikungunya-Virus.
Das SRV ist mit dem menschlichen Rotavirus eng verwandt, das in
Entwicklungsländern
auf der ganzen Welt eine wichtige Ursache von Diarrhöe ist.
-
Zahlreiche
Herpesviren, einschließlich
HSV-1, HSV-2, des Cytomegalovirus, des Varicella- und des Epstein-Barr-Virus, sind wichtige
Krankheitserreger. VV repräsentiert
die Pockenviren, welche das Pockenvirus umfassen, das zu einer großen Bedrohung
in der biologischen Kriegsführung
werden könnte.
-
Diese
Daten zeigen, dass der Wirkstoff (die Wirkstoffe), der bzw. die
in der eine hohe Molekülmasse aufweisenden
Fraktion eines Embryonalextrakts vorhanden ist bzw. sind, möglicherweise
eine antivirale Breitbandwirkung besitzt bzw. besitzen. Das Fehlen
einer Zytotoxizität
erhöht
das klinische Potential dieser Verbindung. Es wurde festgestellt,
dass das aus einem Embryonalextrakt herausgesäuberte Protein hemmende Wirkungen
gegenüber
einem Spektrum nicht verwandter Viren, einschließlich San Angeln, Affen-Rotavirus, Typ-1-Herpes
und Vaccinia, aufweist. TABELLE
I Testvirus
= San-Angeln-Virus
| VERSUCH
# | EV/SAC1 – visuell |
| VERBINDUNG
# | embryonales
Protein |
| CC50: | > 20% |
| EC50: | 12,5% |
| SI: | > 1,6 |
| ANMERKUNG: | schwache
Aktivität |
| | |
| VERSUCH
# | EV/SAC1 – Neutralrot-Assay |
| VERBINDUNG
# | embryonales
Protein |
| CC50: | > 20% |
| EC50: | 7,7% |
| SI: | > 2,6 |
| ANMERKUNG: | mäßige Aktivität |
| | |
| VERSUCH
# | EV/SAC2 – visuell |
| VERBINDUNG
# | Ribavirin |
| CC50: | 560 μg/ml |
| EC50: | 30 μg/ml |
| SI: | 19 |
| ANMERKUNG: | sehr
gute Aktivität |
| | |
| VERSUCH
# | EV/SAC2 – Neutralrot-Assay |
| VERBINDUNG
# | Ribavirin |
| CC50: | 530 μg/ml |
| EC50: | 30 μg/ml |
| SI: | 18 |
| ANMERKUNG: | sehr
gute Aktivität |
TABELLE
II Testvirus
= Affen-Rotavirus
| VERSUCH
# | EV/RtC1 – visuell |
| VERBINDUNG
# | embryonales
Protein |
| CC50: | 11% |
| EC50: | 1,6% |
| SI: | 6,9 |
| ANMERKUNG: | mäßige Aktivität |
| | |
| VERSUCH
# | EV/RtC1 – Neutralrot-Assay |
| VERBINDUNG
# | embryonales
Protein |
| CC50: | > 20% |
| EC50: | 3% |
| SI: | > 6,7 |
| ANMERKUNG: | mäßige Aktivität |
| | |
| VERSUCH
# | EV/RtC2 – visuell |
| VERBINDUNG
# | Ribavirin |
| CC50: | > 100 μg/ml |
| EC50: | 18 μg/ml |
| SI: | > 5,6 |
| ANMERKUNG: | mäßige Aktivität |
| | |
| VERSUCH
# | EV/RtC2 – Neutralrot-Assay |
| VERBINDUNG
# | Ribavirin |
| CC50: | > 100 μg/ml |
| EC50: | 56 μg/ml |
| SI: | > 1,6 |
| ANMERKUNG: | schwache
Aktivität |
TABELLE
III Testvirus
= Herpes Simplex Typ I
| VERSUCH
# | EV/H1C1 – visuell |
| VERBINDUNG
# | embryonales
Protein |
| CC50: | > 20% |
| EC50: | 12% |
| SI: | > 1,7 |
| ANMERKUNG: | schwache
Aktivität |
| | |
| VERSUCH
# | EV/H1C1 – Neutralrot-Assay |
| VERBINDUNG
# | embryonales
Protein |
| CC50: | > 20% |
| EC50: | 10% |
| SI: | > 2 |
| ANMERKUNG: | schwache
Aktivität |
| | |
| VERSUCH
# | EV/H1C2 – visuell |
| VERBINDUNG
# | Acyclovir |
| CC50: | > 100 μg/ml |
| EC50: | 0,6 μg/ml |
| SI: | > 167 |
| ANMERKUNG: | ausgezeichnete
Aktivität |
| | |
| VERSUCH
# | EV/H1C2 – Neutralrot-Assay |
| VERBINDUNG
# | Acyclovir |
| CC50: | > 100 μg/ml |
| EC50: | 0,4 μg/ml |
| SI: | > 250 |
| ANMERKUNG: | ausgezeichnete
Aktivität |
TABELLE
IV Testvirus
= Vacciniavirus
| VERSUCH
# | EV/VC1 – visuell |
| VERBINDUNG
# | embryonales
Protein |
| CC50: | 11% |
| EC50: | > 20% |
| SI: | < 0,6 |
| ANMERKUNG: | im
Wesentlichen keine Aktivität |
| | |
| VERSUCH
# | EV/VC1 – Neutralrot-Assay |
| VERBINDUNG
# | embryonales
Protein |
| CC50: | > 20% |
| EC50: | 8,4% |
| SI: | > 2,4 |
| ANMERKUNG: | schwache
Aktivität |
| | |
| VERSUCH
# | EV/VC2 – visuell |
| VERBINDUNG
# | HPMPC |
| CC50: | > 100 μg/ml |
| EC50: | 5,4 μg/ml |
| SI: | > 18 |
| ANMERKUNG: | sehr
gute Aktivität |
| | |
| VERSUCH
# | EV/VC2 – Neutralrot-Assay |
| VERBINDUNG
# | HPMPC |
| CC50: | > 100 μg/ml |
| EC50: | 1,7 μg/ml |
| SI: | > 59 |
| ANMERKUNG:
ausgezeichnete Aktivität | |
TABELLE
V Testvirus
= venezolanische Pferdeenzephalitis
| VERSUCH
# | EV/VEC3 – visuell |
| VERBINDUNG
# | embryonales
Protein |
| CC50: | > 20% |
| EC50: | 13% |
| SI: | > 1,5 |
| ANMERKUNG: | schwache
Aktivität |
| | |
| VERSUCH
# | EV/VEC3 – Neutralrot-Assay |
| VERBINDUNG
# | embryonales
Protein |
| CC50: | > 20% |
| EC50: | 17% |
| SI: | > 1,2 |
| ANMERKUNG: | Schwache
Aktivität.
Einige Zellen gingen während des |
| | Spülvorgangs
von der Platte verloren; die Neutralrot- |
| | Daten
sind daher fragwürdig. |
| | |
| VERSUCH
# | EV/VEC4 – visuell |
| VERBINDUNG
# | Ribavirin |
| CC50: | > 100 μg/ml |
| EC50: | 7,6 μg/ml |
| SI: | > 13 |
| ANMERKUNG: | sehr
gute Aktivität |
| | |
| VERSUCH
# | EV/VEC4 – Neutralrot-Assay |
| VERBINDUNG
# | Ribavirin |
| CC50: | > 100 μg/ml |
| EC50: | > 100 μg/ml |
| SI: | ? |
| ANMERKUNG: | Keine
Aktivität
war zu beobachten. Einige Zellen |
| | gingen
beim Spülvorgang
von der Platte verloren; die |
| | Neutralrot-Daten
sind bei diesem Versuch daher |
| | fragwürdig. |
-
7. BEISPIEL: ANTIVIRALE WIRKUNGEN GEGEN
DAS HUMANE IMMUNDEFIZIENZVIRUS TYP 1
-
Die
Fähigkeit
des Wirkstoffs bzw. der Wirkstoffe, der bzw. die in der eine hohe
Molekülmasse
aufweisenden Fraktion eines Embryonalextrakts vorhanden ist bzw.
sind, eine Infektion durch das humane Immundefizienzvirus Typ 1
(HIV-1) zu hemmen, wurde unter Verwendung von das LacZ-Reportergen
enthaltenden CD4+HeLa P4-Indikatorzellen unter der Kontrolle der
viralen langen terminalen Sequenzwiederholung (LTR) untersucht.
Der Viruseintritt hochreguliert die Expression des Reporterkonstrukts
und ermöglicht
dabei die Quantifizierung einer Infektion durch Messung der LacZ-Aktivität. Ein Embryonalextrakt
von hoher Molekülmasse
wurde durch Gelfiltration hergestellt, wie obenstehend in Abschnitt
6 dargelegt wurde. Indikatorzellen wurden mit einer Konzentration
von 104 Zellen pro Mulde in Mikroplattenmulden
eingebracht und über
Nacht kultiviert. Die Medien wurden dann gegen 100 μl Embryonalfraktion
von hoher Molekülmasse
in Verdünnungen mit
einem Medium getauscht, wie in 4 angegeben,
und die Zellen wurden mit 100 μl
ov-Virus (HIV-1,
NDK, 2 μg
p24/ml) infiziert und 24 Stunden lang inkubiert. Der Überstand
wurde dann entfernt, und die Zellen wurden mit 50 μl/Mulde mit
PBS/1% NP40 lysiert. Daraufhin wurden 50 μl Indikatorsubstrat (CPRG) pro
Mulde hinzugefügt,
und die OD bei 575 nm wurde gemessen.
-
Um
die Wirkung eines Extrakts auf die Zelllebensfähigkeit festzustellen, wurden
die Kulturen einem MTT-Assay wie folgt unterzogen. Die Zellen wurden
behandelt und infiziert wie im vorhergehenden Absatz beschrieben.
Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit MTT enthaltendem Medium ergänzt und
weitere 3 Stunden lang inkubiert. Der Überstand wurde dann entfernt,
und die Zellen wurden in angesäuertem
Isopropanol lysiert, und die OD bei 575 nm wurde gemessen.
-
4 zeigt
die Resultate der Infektions- und Toxizitätsanalysen, die darauf hindeuten,
dass eine Virusinfektion bei Konzentrationen, die für die Zellen
im Wesentlichen nicht toxisch waren, wirksam gehemmt wurde.
-
Als
Infektiositätsanalysen
für eine
Reverse-Transcriptase-Produktion unter Verwendung des felinen Immundefizienzvirus
(FIV, Stamm FIVWO) und feliner peripherer Blutlymphozyten durchgeführt wurden,
war keine Hemmung zu beobachten.
-
8. BEISPIEL: PROTEINE DER FRAKTION VON
HOHER MOLEKÜLMASSE
HEMMEN DIE WUCHERUNG VON KREBSZELLEN
-
Die
Fähigkeit
des Wirkstoffs bzw. der Wirkstoffe, der bzw. die in der eine hohe
Molekülmasse
aufweisenden Fraktion eines Embryonalextrakts vorhanden ist bzw.
sind, die Wucherung von Krebszellen zu hemmen, wurde an der menschlichen
Lungenkrebszelllinie H460 und der menschlichen Brustkrebszelllinie
MDA MB-435 getestet. Ein Embryonalextrakt von hoher Molekülmasse wurde
durch Gelfiltration hergestellt, wie obenstehend in Abschnitt 6
dargelegt, und mittels DEAE-Sepharose weiter gereinigt. Eine menschliche
Lungenkrebszelllinie H460 und eine menschliche Brustkrebszelllinie
MDA MB-435 wurden vom National Cancer Institute in Frederick, Maryland,
erhalten. Die Assays wurden in einer Monoschicht-Zellkultur durchgeführt, wobei
in vitro-IC50-Konzentrationen mittels einer tritiummarkierten Thymidineinbau-Analyse
bestimmt wurden. Insgesamt wurden 15 Mulden für jede Zelllinie untersucht.
-
Insbesondere
wurden die tritiummarkierten Thymidinanalysen folgendermaßen durchgeführt. 1 × 10
4 Zellen wurden in 1 ml RPMI-1640-Medium,
enthaltend 10% fötales
Rinderserum (FBS), in 24-Mulden-Platten plattiert. Die Kulturen
wurden bei 37°C
und 5% Kohlendioxid 24 Stunden lang inkubiert. Eine Fraktion von
hoher Molekülmasse
wurde zu jeder entsprechenden Mulde hinzugefügt, und das Fortschreiten der
Inkubation wurde für
zusätzliche
72 Stunden ermöglicht.
Die Zellen wurden dann tritiummarkiertem Thymidin in einer Konzentration
von 1 μCi/ml
(ICN, Kat.# 2403905) ausgesetzt und bei 37°C vier Stunden lang inkubiert.
Die Zellen wurden danach zweimal mit kaltem PBS gewaschen, um nicht
eingebautes Thymidin zu entfernen. Die Zellen wurden zweimal mit
10%iger Trichloressigsäure
(Fisher, Lot #94276913), 1 ml pro Mulde, behandelt. Die Zellen wurden
dann durch Behandlung mit 10%igem Natriumlaurylsulfat (Sigma, Kat.#L-3771)
bei 500 μl
pro Mulde aufgebrochen. Aus jeder Mulde wurden Zellen in eine Szintillationsampulle übertragen
und in einem Beckam-Szintillationszähler Modell LS-133 gezählt. Die
Ergebnisse werden in den Tabellen VI und VII und
5–
7 gezeigt. Die Daten zeigten eine statistisch
signifikante Hemmung des Zellwachstums im Vergleich zur Kontrolle,
wenn 200 oder 400 μl/ml
Medium eines Embryonalextrakts von hoher Molekülmasse bei H460-Lungenkrebszellen
(P = 0,03, P = 0,001) und bei allen Verdünnungen (100–400 μl Extrakt/ml
Medium) für
MDA MB 435-Zellen verwendet wurden. TABELLE VI Hemmung der menschlichen Krebszelllinie
H460 nach Behandlung mit Extrakt
| Dosis
Extrakt (μl/ml) | Thymidineinbau
(mittlere cpm) | Hemmungsreaktion
(IR) | p-Wert* |
| 0 | 110207 ± 4706 | 0 | |
| 100 | 78208 ± 39520 | 29% | 0,289 |
| 150 | 68630 ± 34418 | 38% | 0,206 |
| 200 | 53499 ± 15597 | 51% | 0,03 |
| 400 | 8863 ± 88 | 92% | 0,001 |
TABELLE VII Hemmung der menschlichen Brustkrebslinie
MDA MB435 nach Behandlung mit Extrakt | Dosis
Extrakt (μl/ml) | Thymidineinbau
(mittlere cpm) | Hemmungsreaktion
(IR) | p-Wert* |
| 0 | 158195 ± 18458 | 0 | |
| 100 | 111251 ± 7413 | 30% | 0,034 |
| 150 | 100715 ± 10505 | 36% | 0,019 |
| 200 | 85256 ± 6676 | 46% | 0,022 |
| 400 | 2082 ± 463 | 99% | 0,005 |
-
Die
Hemmung ist in 5, 6A und 6B und 7A und 7B für gepoolte
Resultate für beide
Linien und insbesondere für
die MDA-MB-435- bzw. die H460-Linie dargestellt. IC50s wurden berechnet, indem
die Dosis-Effekt-Kurven bei dem eine hohe Molekülmasse aufweisenden Extrakt
für H460
und MDA MB 435 mittels MicroSoft Excel grafisch dargestellt wurden.
Eine Trendlinie wurde festgelegt und Hemmkonzentrationen wurden
extrapoliert, indem die Konvergenz des 0,5 IR- zum Extraktvolumen
entlang der Dosis-Effekt-Kurve bestimmt wurde. Es wurde ermittelt,
dass die 50-Prozent- Hemmkonzentration
für H460
205 μl/ml betrug.
Es wurde ermittelt, dass die 50-Prozent-Hemmkonzentration für MDA MB 435 202 μl/ml betrug.
Bei menschlichen MDA-MB-435-Brustkrebszellen
und H460-Lungenkrebszellen lag die hemmende Aktivität, die erzielt
wurde, bei 99% bzw. 92%.
-
9. BEISPIEL: CHARAKTERISIERUNG ANTIPROLIFERATIVER
PEPTIDE VON GERINGER MOLEKÜLMASSE
-
Lebern
von Schweineembryos wurden in einem einen antiproteolytischen Cocktail
enthaltenden Puffer homogenisiert und durch einen Durchlauf durch
eine große
(750 ml) Sephacryl S-100-Gelfiltrationssäule fraktioniert. 4 ml-Fraktionen
wurden gesammelt und hinsichtlich der Aktivität analysiert, indem sie zu
gezüchteten
MCF-7-Zellen hinzugefügt
wurden, gefolgt nach 4 Tagen von einer Bestimmung der Aufnahme von
radiomarkiertem Thymidin durch die Zellen. Zwei Bereiche des Chromatogramms
von der Sephacryl-Säule
wiesen antiproliferative Aktivität
auf, wobei einer Spezien von höherer
Molekülmasse
(typischerweise Röhrchen 40–60) und
ein anderer Spezien von geringerer Molekülmasse (etwa bei Röhrchen 100–110) entsprach.
-
Die
eine höhere
Molekülmasse
aufweisenden aktiven Fraktionen aus der Gelfiltrationssäule wurden gepoolt,
dialysiert, um Salz zu entfernen, und zwecks Konzentration lyophilisiert.
Das Material wurde auf eine HPLC-DEAE-Ionenaustauschersäule aufgebracht
und mit einem linearen Gradienten von 0–1 M NaCl eluiert. Das gesamte
biologisch aktive Material eluierte im frühen Teil des Chromatogramms,
welcher einem Material entsprach, das nicht an das Harz absorbierte.
Eine beträchtliche
Menge an Protein wurde an der Säule
zurückbehalten,
was somit eine erhebliche Reinigung des aktiven embryonalen Faktors
ermöglichte.
-
Nach
einer Dialyse gegen Wasser zur Entfernung von Salzen, gefolgt von
einer Lyophilisierung, wurden die aktiven Fraktionen vom DEAE-Peak
einer Massenspektrometrie mit einem PerSeptive Biosystems Voyager
Elite MALDI-TOF-Massenspektrometer unterzogen. Nur einige Peaks
waren von den gepoolten aktiven Fraktionen zu sehen, einschließlich großer Komponenten
mit Molekülmassen
von 10821, 14832 und 14987 Da. Mehrere kleinere Peaks wurden bei
5411 und 7477 Da festgestellt. Bei höheren oder geringeren Molekülmassen
wurden keine Peaks festgestellt. Dieses Ergebnis weist auf eine
beträchtliche
Reinigung des aktiven Materials hin.
-
Die
eine geringe Molekülmasse
aufweisenden Fraktionen aus der Gelfiltrationssäule wurden gepoolt und lyophilisiert.
Sie wurden in Wasser wiederhergestellt und auf eine C18-Umkehrphasen-HPLC-Säule aufgebracht.
Puffer A war 0,1% Trifluoressigsäure
in Wasser; Puffer B war 0,1% Trifluoressigsäure in 99,9% Acetonitril. Die
Säule wurde
mit einem linearen Gradienten von 0–100% Puffer B innerhalb 1
Stunde entwickelt. Fraktionen wurden gesammelt und im MCF-7-Assay
auf die biologische Aktivität
untersucht. Die Aktivität schien über die
Fraktionen 10–20
verteilt zu sein, und sehr wenig Protein war am Chromatogramm innerhalb dieses
Bereichs zu sehen.
-
Nach
einer Konzentration der gepoolten Fraktionen ließen Massenspektren ein Peptid
von ungefähr 820
Da erkennen, das in allen aktiven Fraktionen aus der Umkehrphasensäule vorhanden
war und in den nicht aktiven Bereichen der Säule fehlte. Versuche wurden
durchgeführt,
um seine Struktur zu bestimmen, indem ein kontrollierter proteolytischer
Aufschluss unter Verwendung von Carboxypeptidase Y durchgeführt und
die fortschreitende Fragmentierung des Peptids durch Massenspektrometrie
analysiert wurde. Obwohl eine gewisse Heterogenität im proteolytischen
Fragment vorhanden zu sein schien, war es möglich, die Spektren mit den folgenden
heptameren Polypeptiden zu versehen.
-
NH2 – Cys – Val – His – (Ala,
Ser, Thr) – (Tyr,
Phe) – Arg – (Ser – Ala) – COOH
-
Dieses
Peptid wurde in all seinen Kombinationen durch manuelle SSPS synthetisiert,
wobei Fmoc (9-Fluorenylmethoxycarbonyl) als aminoterminale Schutzgruppe
verwendet wurde. An jeder Position, an der mehr als eine Aminosäure möglich war,
wurde ein Gemisch der mutmaßlichen
Aminosäuren
zu dem entstehenden Peptid hinzugefügt, um ein Endprodukt zu erzeugen,
das alle möglichen
Kombinationen enthielt.
-
Dieses
kombinatorische Gemisch wies keine hemmende Aktivität auf, als
es durch Messung der Aufnahme von radiomarkiertem Thymidin durch
MCF-7-Zellen in einer Kultur untersucht wurde. Es ist wahrscheinlich,
dass dieses Fehlen einer Wirkung auf die Tatsache zurückzuführen ist,
dass das Peptidgemisch aus Peptidanaloga mit hoher Sequenzhomologie
besteht, wovon einige möglicherweise
imstande sind, mit aktiven Peptiden für Rezeptorstellen an den MCF-7-Zellen
zu konkurrieren, jedoch keine biologische Aktivität besitzen. Demgemäß wurde
das Peptidgemisch dann durch Umkehrphasen-HPLC aufgetrennt (
8),
und die einzelnen Peptide (A-M) wurden gesammelt, durch Vakuumzentrifugation
(Speed Vac) getrocknet und im MCF-7-Assay zweifach getrennt untersucht
(
9). Die Peaks A, F und K wiesen im Vergleich zu
einer negativen Kontrolle (Puffer allein) eine beträchtliche
antiproliferative Aktivität
auf, während
die anderen Peptide weniger aktiv waren oder keine Aktivität zeigten.
Die Peptide A, F und K besaßen
allesamt Molekülmassen
von 818,6 kDa, was gemäß Berechnung
mit den folgenden Sequenzen übereinstimmt:
NH2-Cys-Val-His-Ala-Phe-Arg-Ser-COOH
(SEQ ID NO: 3)
NH2-Cys-Val-His-Ala-Tyr-Arg-Ala-COOH (SEQ ID
NO: 2)
NH2-Cys-Val-His-Ser-Phe-Arg-Ala-COOH (SEQ ID NO: 8) SEQUENZPROTOKOLL
